期刊：CellRep

影响因子：7.5

主要技术：scRNA‐seq、Xenium、流式分选

导语

胰腺导管腺癌 （PDAC） 是美国癌症相关死亡的第三大原因，5 年总生存率仅为 12%。当在晚期诊断时，这一比例下降到只有 3%，迫切需要更好的治疗方案。PDAC 具有结纤维增生性肿瘤微环境 （TME），其中癌细胞被各种未转化的细胞类型和致密的细胞外基质 （ECM） 包围。这种 TME 损害血管功能，限制营养和氧气的输送，从而导致严重的组织缺氧. PDAC 被认为是最缺氧的人类癌症之一，缺氧增加与更晚期的疾病阶段以及对放疗和化疗的耐药性有关。本研究探讨了压力下脂质稳态的重要性。通过在营养稀缺的情况下缓解内质网 （ER） 应激来维持 PDAC 细胞活力。此外，CAFs 的缺氧性低于体内相邻的恶性细胞，因此它们是不饱和脂质的潜在来源。CAF 条件培养基在营养和缺氧时促进 PDAC 细胞存活，这种效果被脱脂逆转。这些发现显示了一种关键的脂质“交叉喂养”机制，可促进 PDAC 细胞存活，为治疗提供潜在的代谢靶点。

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主要技术

scRNA‐seq，Xenium，流式分选

主要结果

1. 胰腺癌细胞对肿瘤样应激敏感

为了模拟 PDAC 密集结纤维增生引起的缺氧和营养应激，在“肿瘤样条件下”培养了一组 PDAC 细胞系，其中使用 0.5% 胎牛血清 （FBS） 确保营养有限，并通过维持 0.5% O2 来缺氧，称为“SO 应激”（图 1A）。多种 PDAC 细胞系，包括 PANC-1、Su.86.86 和 Capan-2，在 SO 条件下表现出细胞活力降低（图 1B），这似乎是由细胞凋亡和铁死亡介导的（图 1C 和 1D）。虽然正常胰腺的 O2 浓度通常为 5%-7%，但胰腺癌细胞在这些生理条件下保持活力（图 S1A），与它们在 21% O2 的表型一致（称为“常氧”），这是一种常用于组织培养实验的情况。脂质饱和度增加会改变细胞膜组成并降低膜流动性，从而产生 ER 应激并触发未折叠蛋白反应 （UPR） 的 IRE1α 依赖性臂。激活的 IRE1α 固有的 RNase 活性从 X 盒结合蛋白 （XBP1） mRNA 中剪接出一个 26 个碱基的序列，从而编码剪接的 XBP1 以启动关键的 UPR 程序（图 1E）。正如预期的那样，缺氧 PANC-1 细胞中的脂质“饱和指数”（饱和硬脂酸盐与不饱和油酸盐水平的比率）升高（图 1J ）。外源供应的油酸通过减轻 IRE1α/XBP 活化来降低 ER 应激，并恢复了 PANC-1、Su.86.86 和 Capan-2 细胞系的活力（图 1K 和 1L）。相比之下，在 SO 应激下补充油酸并不能挽救增殖，表明降低的脂肪酸饱和度指数不足以恢复所有合成代谢途径。

数据表明，不饱和脂肪酸的可用性是 SO 条件下 PDAC 细胞存活的关键决定因素（图 1N）。为了直接测试这一点，我们将 PDAC 细胞暴露于 SCD1 抑制剂中，即使在 O 2 存在下也能阻断脂肪酸去饱和（图 2A），模拟缺氧对 SCD 酶活性的抑制。尽管 Mia PaCa-2、PL-45、PANC-1、Su.86.86 和 KPC4662 细胞在 0.5% 血清中存活，但用 SCD1 抑制剂的额外处理诱导细胞死亡（图 2B），其被半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD 逆转 （图 2C） 而不是铁司他汀 （图 2D）。在这种情况下，常氧下的 SCD1 抑制诱导细胞凋亡而不是铁死亡，因为铁死亡敏感性主要抗氧化酶 GPX4 损伤、缺氧诱导的铁摄取和脂质过氧化增强.34 外源供应的油酸盐完全抵消了 SCD1 抑制对细胞活力（图 2E）和 IRE1α 活化（图 2F）的影响。因此，不饱和脂质种类的可用性降低是导致经历肿瘤样应激的脂肪生成 PDAC 细胞中诱导 ER 应激和细胞凋亡的主要原因。

图1

图2

2. 胰腺癌细胞和成纤维细胞基质细胞在体内具有不同的缺氧特征

观察到 PDAC 肿瘤块内富含成纤维细胞的位置明显低于两个小鼠 KPC （KrasLSLG12D/+;Trp53fl/fl;p48-Cre）和人 PDAC 组织 （图 3A）。具体来说，荷瘤小鼠注射哌莫硝唑，它与 O2 水平低于 1.3% 的细胞大分子形成共价键，并通过 hypoxyprobe 免疫组化检测，缺氧探针染色的 PDAC 肿瘤肿块的切片显示缺氧位置，并清楚地表示未染色的选定区域，表明后者是 O 2 水平大于 1.3% 的位置（图 3A）。在这种情况下，我们注意到缺氧区域与 YFP+ 恶性上皮细胞特异性重叠，而成纤维细胞 α-SMA+ 细胞仍未被哌莫硝唑染色（图 3B）。因此，我们假设 PDAC TME 内的肌成纤维细胞基质细胞可以得到足够的氧合以支持从头合成的脂肪酸的去饱和。此外，小鼠 PDAC 样品的免疫荧光染色显示，由于靠近血管，肌成纤维细胞 （myCAF） 的缺氧性较低（图 3C）。为了进一步探索小鼠和人 PDAC 中的这一观察结果，我们分析了先前报道的单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 数据。44 基因缺氧特征显示，与小鼠样品中的缺氧导管细胞相比，PDAC CAFs 中的缺氧基因表达降低（图 3D）实际上，小鼠 KPC 肿瘤 myCAFs 和 iCAFs 都没有表现出缺氧转录特征，而 apCAFs 则表现出缺氧转录特征（图 3E）。在人类 PDAC 样本中，转录定义为 myCAFs 的成纤维细胞也始终比肿瘤细胞低缺氧（图 3E），在 8 次初治 PDAC 手术切除中对 694,624 个单细胞的基因表达谱确定了 17 个主要细胞群，包括基底样和经典样恶性细胞、myCAFs、iCAF 和内皮细胞（图 3F 和 3G）。接下来，我们计算了所有 CAF 和恶性细胞群到最近内皮细胞的距离分布，发现 myCAFs 平均而言比恶性细胞和其他成纤维细胞群更接近内皮细胞（图 3H）。myCAFs 的空间分布比 iCAFs 更靠近内皮细胞，这证实了我们的 HIF 特征基因表达分析，显示 iCAFs 中的高 HIF 活性和 myCAFs 中的低 HIF 活性（图 3E）。最后，最近一项对 9 个人 PDAC 切片使用多重成像质谱流式细胞术的研究还显示，与肿瘤细胞相比，基质/ECM 群体更接近内皮细胞，并且在血管邻域中高度富集。

图3

3. CAF 在体内和人类类器官模型中促进小鼠胰腺癌细胞的生长

为了确定调节 CAF 和 PDAC 细胞之间分子串扰的关键成分，我们获得了小鼠和人 PSC 细胞系（STAR 方法），但请注意，所有这些本质上都是源自 PDAC 肿瘤的 myCAF（即 α-SMA+、desmin+;因此，我们在此处将它们称为“CAF”。我们首先生成了由 CAF 调节的培养基，CAFs 在 21% O 2 或 0.5% O 2 下在无血清培养基中培养 48 小时，然后如前所述收集和浓缩培养基（图 4A）。CAF条件培养基在 SO 应激下挽救了 PANC-1 和 Su.86.86 细胞存活，而浓缩的未条件培养基则没有（图 4B-4D 和 S3A）。条件培养基还降低了 PDAC 细胞中的 IRE1α 活化（图 4E）。有趣的是，在低氧或常氧条件下培养的 CAF 的条件培养基通过缓解 IRE1α/XBP 通路的激活，在挽救 PDAC 细胞活力和 ER 应激反应方面同样有效（图 4C 和 4D）。最后，我们证明来自小鼠 CAFs 的条件培养基在缺氧和营养应激下也能维持小鼠 KPC4662 PDAC 细胞的数量（图 4F）。为了探索体内 CAF-PDAC 相互作用，我们将 KPC4662 细胞和小鼠 CAFs 皮下注射到同基因小鼠中。相对于“单独 PDAC”对照，来自联合 CAF-PDAC 样本的肿瘤表现出生长速率和重量增加（图 4G 和 4H）。在人 CAF 条件培养基中培养的类器官在缺氧下表现出增殖增加和细胞死亡减少（图 4I），与未处理的对照相比，球体中更多的活细胞和更大的类器官直径证明了这一点（图 4J 和 4K）。总的来说，CAF 明确支持小鼠 PDAC 肿瘤体内生长和人 PDAC 类器官体外生长，扩展了从先前使用已建立的 PDAC 细胞系的工作中得出的结论。

图4

4. LPC 是 CAF-PDAC 串扰中支持脂质稳态的关键代谢物

我们使用硅胶树脂从 CAF 条件培养基中去除脂质。重要的是，二氧化硅处理的培养基对 PDAC 细胞没有毒性（图 S5A），但它不再支持 SO 应激下的细胞活力（图 5A、5B 和 S5B）。接下来，我们使用液相色谱-质谱法 （LC-MS） 进行了脂质组学分析测定（图 5C），并鉴定了 90 种不同的脂质种类，其中 LPC 在 CAF 条件培养基中显著富集（图 5D;表 S1）.在 SO 条件下，CAF 分泌的 LPC 被 PANC-1 细胞从条件培养基中特异性耗尽（图 5D-5G）有趣的是，低氧和常氧 CAF 培养基中的不饱和 LPC 水平相似（图 5F），这与两者挽救 PDAC 细胞活力的能力一致（图 3I 和 4E）。此外，这些结果也与体内观察一致，即 PDAC CAFs 维持高于 1.3% 的 O 2 水平，并且不会表现出由 HIF1α 表达和转录特征表示的缺氧诱导的压力（图 3A-3E）。

5. LPC 利用受阻会破坏 CAF-PDAC 串扰

为了确定输入到 PDAC 细胞中的 LPC 的生化归宿，我们用 LPC （17：0） 或 LPC （17：1） 培养 PANC-1 细胞，并通过 LC-MS 追踪酰基链 C17 的归宿。这种示踪测定将外源性 LPC 与天然 LPC 区分开来，因为天然 LPC 在酰基链中仅包含偶数碳数（图 6A）。我们验证了具有 C17 酰基链的外源 LPC 在处理下的 PDAC 细胞中高度富集，并且未检测到天然 LPC 干扰（图 6B）。随着培养时间的增加，在 PANC-1 细胞中检测到掺入 PC 的 C17 和甘油三酯 （TG） 水平升高（图 6C 和 6D）。PC 是细胞膜中最丰富和最重要的脂质成分，不饱和 PC 水平增加会降低膜刚度，增强膜流动性，并抑制膜相关应激途径的激活。重要的是，TSI-01 未能破坏 XBP1 敲除细胞中 LPC 介导的 PDAC 细胞活力拯救，表明 TSI-01 部分通过诱导 ER 应激引起细胞毒性（图 6H）。此外，皮下小鼠模型中的 TSI-01 治疗显示 KPC4662 和小鼠 CAF 共同植入组对肿瘤进展的显着抑制（图 6I）。这些观察结果表明，在类似 TME 的应激条件下，将进口的不饱和 LPC 转化为不饱和 PC 对于 PDAC 细胞的存活至关重要。

图6

6. 热量限制饮食结合脂肪酸合成抑制破坏体内 CAF-PDAC 串扰

我们重复了 KPC4662 细胞和小鼠 CAFs 的同基因共注射，只是这次我们让小鼠保持 CR 饮食（STAR 方法）。正如预期的那样，CAFs 促进了肿瘤生长，并且在联合注射组中观察到的肿瘤比使用这种饮食方案的对照组更大（图 7A7C）。喂养 CR 饮食并消除 CAFs 中的 Fasn表达削弱了它们促进肿瘤细胞增殖的能力（图 7D 和 7E）。我们的结果与一个模型一致，其中 CAFs 通过分泌不饱和脂质，特别是 LPC 来维持 PDAC 细胞体内存活和增殖，PDAC 细胞吸收并使用它来合成不饱和 PC（图 7F），从而避免脂毒性 ER 应激、细胞凋亡和铁死亡。令人惊讶的是，CAFs 在 PDAC 肿瘤中没有明显的缺氧性，这为如何在其他代谢“干旱”的 PDAC TME 中合成脂肪酸提供了解释。

图7

导语

不饱和 LPC 的 CAF-PDAC 串扰对于在缺氧和营养稀缺条件下的 PDAC 细胞存活至关重要。CAF 对缺氧的抵抗力更强，能够分泌不饱和 LPC，这是 PDAC 细胞维持其活力在脂毒性应激期间的首选。LPC 由 PDAC 细胞高效导入并转化为 PC 以进行膜完整性恢复。因此阻断 PDAC 细胞中的 LPC 代谢可能是未来一种有吸引力的治疗方式，这将有利于 PDAC 患者的恢复。

参考文献：

Han X, Burrows M, Kim LC股票配资配资天下, Xu JP, Vostrejs W, Van Le TN, Poltorack C, Jiang Y, Cukierman E, Stanger BZ, Reiss KA, Shaffer SM, Mesaros C, Keith B, Simon MC. Cancer-associated fibroblasts maintain critical pancreatic cancer cell lipid homeostasis in the tumor microenvironment. Cell Rep. 2024 Nov 26;43(11):114972. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114972. Epub 2024 Nov 12. PMID: 39535921; PMCID: PMC11648993.

发布于：上海市

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